97免费观看视频,成人福利在线,97国产成人精品视频,九九色综合,国产第一福利,99精品福利视频,久久精品福利

當前位置:首頁(yè) > 新聞資訊 > 行業(yè)新聞

NEWS

新聞資訊

科研合作

融合基因檢測:DNA or RNA該怎么選?

新聞來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:[2024-09-29]

 

01.什么是基因融合

 

基因融合是指兩個(gè)基因的部分或全部序列相互融合為一個(gè)新的基因的過(guò)程。一定比例的融合基因會(huì )被轉錄成嵌合融合轉錄物,這些嵌合融合轉錄物可以通過(guò)保留其親本基因的閱讀框架形成融合蛋白,可以影響親本基因表達或作為長(cháng)的非編碼嵌合RNA發(fā)揮作用。

 

一般來(lái)說(shuō),基因融合是指基因組層面的融合。但轉錄組層面也可能發(fā)生融合,主要是由于兩個(gè)不同基因轉錄產(chǎn)生的RNA,由于某種原因融合在了一起,形成新的融合RNA,該RNA可能編碼蛋白,也可能為非編碼。而基因組層面產(chǎn)生的融合基因,根據融合的情況,可能表達,也可能不表達(如破壞了啟動(dòng)子區域或其他原因)。

 

▲融合基因示意圖


02.融合基因的產(chǎn)生機制

由于染色體層的重排或轉錄過(guò)程中的錯誤剪接所造成的。在DNA層面上的重排主要包括了6種形式:

1. 染色體內的易位和染色體間的易位;

2. 大片段的插入;

3. 大片段缺失;

4. 串聯(lián)重復;

5. 倒置;

6. 染色體碎裂導致的復雜重排。


 ▲DNA層面上的重排形式


在RNA層面上,轉錄過(guò)程中的“通讀事件”也可能產(chǎn)生融合蛋白。當RNA聚合酶不能正確終止一個(gè)基因末端的轉錄,并且由于異常剪接而繼續轉錄到下一個(gè)基因末端時(shí),產(chǎn)生了嵌合轉錄子稱(chēng)之為“通讀事件”,并不涉及基因組物質(zhì)的重排(DNA重排)即可產(chǎn)生融合轉錄子。


 ▲轉錄過(guò)程中的“通讀事件”

 

03.融合基因常見(jiàn)檢測方法


FISH

通過(guò)熒光標記的探針與細胞核內的DNA 靶序列雜交,并在熒光顯微鏡下觀(guān)察分析基因擴增或融合變異的一種分子檢測技術(shù),一般被認為是檢測基因擴增和融合的“金標準”,但也存在一定的局限性。如并非所有檢測到的融合均會(huì )產(chǎn)生可表達的融合RNA,分離探針可能會(huì )遺漏較小的染色體內重排導致假陰性結果,無(wú)法確定和區分不同的融合基因變異亞型等。

 

IHC

利用抗原抗體反應和化學(xué)顯色原理,檢測組織或細胞學(xué)切片中特定蛋白表達的技術(shù)。IHC檢測靈敏度高、成本低、檢測時(shí)間短、易于自動(dòng)化,但其準確性取決于檢測的融合蛋白是否有經(jīng)過(guò)驗證的抗體,如VentanaD5F3 IHC檢測肺腺癌患者ALK 融合的準確性高,而 ROS1和NTRK陽(yáng)性IHC結果尚需其他檢測方法驗證。

 

RT-PCR

在RNA水平檢測融合RNA,靈敏度高、檢測時(shí)間短,但僅限于檢測引物設計范圍內的已知融合,無(wú)法檢出未知融合。此外,該方法檢測結果的準確性高度依賴(lài)標本RNA的質(zhì)量

 

靶向二代測序

通過(guò)大規模平行測序的方法,對引物或探針設計范圍內的區域同時(shí)進(jìn)行多個(gè)融合基因檢測。根據核酸投入物的不同,靶向二代測序可在DNARNA水平檢測基因融合。

根據中心法則,以DNA為模板通過(guò)轉錄和剪接加工產(chǎn)生成熟的RNA。在DNA水平上,融合斷點(diǎn)位置通常發(fā)生在較長(cháng)的內含子區域,且融合的斷裂點(diǎn)不同患者可能不同,故用傳統的PCR直接擴增斷裂點(diǎn)是不易實(shí)現的,采用NGS的方法設計探針去抓取斷裂點(diǎn)是一種可行的檢測方法,但從DNA水平檢測融合基因不可避免存在如下局限性和挑戰:

 

1.融合基因的斷點(diǎn)一般在內含子區域,而融合基因的內含子又特別冗長(cháng),因此,如果基于DNA-based的檢測方法就要在內含子區域鋪設大量的探針,探針設計難度大。

2.大量探針也會(huì )導致下機數據量過(guò)大(增加實(shí)驗成本,加大生信分析難度)。

3.大量探針仍會(huì )存在覆蓋盲點(diǎn),導致融合漏檢。

4.DNA層面出現融合不一定能轉錄成mRNA進(jìn)而翻譯成蛋白質(zhì),進(jìn)而不能激活下游MAPK/mTOR通路,而RNA則相對更接近翻譯成為蛋白質(zhì)。

 

相比DNA水平,RNA水平上融合基因表現為前后兩個(gè)基因外顯子之間的銜接,融合點(diǎn)相對固定。這一特征為精準設計探針或引物提供了先天優(yōu)勢。因此,根據融合基因序列特點(diǎn),在RNA水平上檢測融合基因比DNA水平更易實(shí)現。


 ▲融合基因常見(jiàn)的檢測方法

 

04.融合基因檢測:DNA vs RNA

 

DNA-based NGS

原理:對可能發(fā)生融合的區域設計探針進(jìn)行覆蓋,雜交捕獲得到目的片段進(jìn)行測序分析。

通過(guò)雜交捕獲建庫,僅使用DNA就可同時(shí)對多個(gè)腫瘤相關(guān)基因的突變、擴增、融合及腫瘤突變負荷(TMB)、微衛星不穩定狀態(tài)進(jìn)行檢測,極大地節約了標本量,并且能夠在DNA水平確定基因融合的斷點(diǎn)位置和融合伴侶,檢出已知和未知的基因融合。DNA-based NGS測序是基于腫瘤細胞來(lái)源的DNA分子進(jìn)行檢測。DNA分子由螺旋的雙鏈組成,相對于RNA更加穩定。因此,DNA-based NGS的組織學(xué)/細胞學(xué)樣本,包括新鮮組織、FFPE、胸水等,均可滿(mǎn)足檢測質(zhì)控要求。在組織樣本難以獲取或樣本量不足時(shí),還可以通過(guò)液體活檢提取ctDNA進(jìn)行測序,而這是RNA-based NGS無(wú)法實(shí)現的。但是,DNA二代測序檢測基因融合受腫瘤細胞含量、標本DNA質(zhì)量、捕獲探針覆蓋度及DNA層面復雜基因變異等影響,可能會(huì )出現漏檢。另外,隨著(zhù)DNA二代測序在臨床分子檢測中的廣泛應用,越來(lái)越多攜帶罕見(jiàn)伴侶的激酶融合被發(fā)現,但某些罕見(jiàn)融合并不能產(chǎn)生有功能的融合RNA/蛋白。

 

RNA-based NGS

RNA二代測序可以通過(guò)多重PCR擴增、錨定多重PCR或雜交捕獲建庫在RNA水平檢測融合轉錄本。與DNA二代測序需要對外顯子和內含子區均進(jìn)行探針捕獲相比,RNA測序僅需要針對外顯子區設計引物或探針,相對簡(jiǎn)單、經(jīng)濟,不受DNA層面復雜融合的影響,且RNA二代測序能直接真實(shí)地反映轉錄水平融合的表達情況及融合伴侶基因類(lèi)型。

但是,RNA-based NGS檢測樣本要求相對較高。從樣本質(zhì)量上講,由于存在核糖核酸酶且RNA是單鏈結構,非常容易降解,因此,新鮮組織是做RNA-based NGS檢測的******。有研究表明,高達50%的存檔FFPE樣本,特別是較舊的樣本,不能滿(mǎn)足RNA建庫和測序的要求,可能無(wú)法通過(guò)測序前的質(zhì)量控制。目前尚不推薦從液體活檢樣本中提取RNA進(jìn)行腫瘤融合基因檢測,這也限制了RNA-based NGS檢測的應用。

 

紐約紀念斯隆凱特琳癌癥研究中心(MSKCC)的一項真實(shí)世界肺腺癌大隊列研究和一項中國人群的研究中均通過(guò)RNA-based NGS在DNA NGS檢測陰性的非小細胞肺癌樣本中檢出了10%左右的靶點(diǎn)基因融合或MET跳突,相比DNA水平,RNA水平上融合基因表現為前后兩個(gè)基因外顯子之間的銜接,不受內含子的影響,融合點(diǎn)相對固定,這一特征為精準設計探針或引物提供了先天優(yōu)勢,也是RNA-based NGS比DNA-based NGS檢測融合基因更具優(yōu)勢的原因之一。

 

 ▲紐約紀念斯隆凱特琳癌癥研究中心研究

 ▲中國人群研究

 ▲NGS檢測基因融合對比

 

 

05.總結

相比DNA-based NGS,RNA-based NGS不受內含子影響,可提升融合基因的檢出率。融合基因DNA和RNA水平上的結構特征決定了融合基因檢測,RNA水平遠比DNA水平更敏感,更準確,但是樣本要求較高。

DNA-based NGS對樣本要求相對較低,可聯(lián)合其他biomarker共同檢測,同時(shí)DNA層面可檢出的罕見(jiàn)融合伴侶、外顯子斷點(diǎn)融合及基因間融合,但需在RNA或蛋白水平進(jìn)一步驗證。

在臨床應用中,全面準確地腫瘤靶基因檢測需要臨床實(shí)踐經(jīng)驗的積累以及不斷的總結驗證。基于檢測方法學(xué)的局限性和檢測標本的復雜性,多平臺聯(lián)合應用或補充有益于腫瘤患者的精準診治。

 

參考文獻

[1]Oncotarget. 2019 Mar 12;10(21):2095-2111.

[2]Genome Biol. 2020 Jul 6;21(1):166.

[3]Comput Math Methods Med. 2015:2015:912742

[4]DOI:10.3760/cma.j.cn112151-20221111-00946

[5]Noncoding RNA. 2021 Feb 4;7(1):10

[6]https://doi.org/10.1200/JCO.2024.42.16_suppl.e2004

[7]Clin Cancer Res. 2019 Aug 1;25(15):4712-4722

[8]J Thorac Oncol. 2021 Mar;16(3):404-418.

[9 ]DOI: 10.3779/j.issn.1009-3419.2023.102.43

 

聲明:本文僅用于分享,如涉及版權等問(wèn)題,請盡快聯(lián)系我們,我們第一時(shí)間更正,謝謝!


普兰店市| 达州市| 淮滨县| 巴林右旗| 屏东市| 建湖县| 新巴尔虎右旗| 晋宁县| 门头沟区| 淮南市| 民乐县| 阳高县| 馆陶县| 志丹县| 湾仔区| 泗洪县| 崇义县| 闽清县| 府谷县| 长春市| 平乡县| 仙游县| 延吉市| 湖北省| 南川市| 普格县| 宁南县| 游戏| 施甸县| 阿拉善右旗| 西青区| 孝昌县| 扬州市| 昭苏县| 彭山县| 兴和县| 澄江县| 台东市| 延庆县| 三原县| 葵青区|